細胞計數(shù)是細胞培養(yǎng)過程中的重要步驟，“傳統(tǒng)的細胞計數(shù)方法"是在顯微鏡下使用血細胞計數(shù)板人工計數(shù)。這里博大博聚為大家介紹下傳統(tǒng)細胞計數(shù)的詳細的步驟，供大家參考。

1、準備好血細胞計數(shù)板

1)     先用無水乙醇清潔血細胞計數(shù)板表面和蓋玻片；

2)     再用純水清潔血細胞計數(shù)板表面和蓋玻片；

3)     每次清洗后用洗耳球吹干。

4)     在血細胞計數(shù)板的計數(shù)池上方蓋上專用的蓋玻片。

注意：最好不要擦拭血細胞計數(shù)板的計數(shù)池，防止標識線損壞。

2、制備細胞懸液

1)     貼壁生長的細胞，使用胰酶消化的方法使細胞從培養(yǎng)瓶表面脫落；

2)     漩渦混勻或使用移液器反復(fù)吹吸細胞懸液，盡量減少細胞團簇；

3)     懸浮細胞則可以直接進行取樣計數(shù)；

4)     細胞懸液濃度控制在1×10⁶個細胞/mL左右。

注意：

a)      盡量少、盡量小的細胞團簇；

b)     如需計算活率，則需將細胞懸液按照1：1的比例加入等量的0.4%的臺盼藍染料，混勻后，靜置1~2分鐘。    

3、細胞加樣

1)     移液器輕吹細胞懸液使其混合均勻；

2)     將細胞懸液與臺盼藍染料按1:1體積混合均勻；

3)     取出10uL細胞懸液，將細胞懸液滴加于血細胞計數(shù)板邊緣凹槽處，此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數(shù)池。

注意：                                              

1)     每次加樣前要混勻細胞懸液，防止細胞沉降造成取樣誤差增大；

2)     加樣過程中，要一次性將細胞懸液注入計數(shù)室，防止氣泡產(chǎn)生，否則要重做；

3)     加樣時不要將細胞懸液直接吹入計數(shù)池，會造成細胞分布不均勻。

4、 人工細胞計數(shù)

計數(shù)工具：10X物鏡的顯微鏡、血細胞計數(shù)板。

1)     加樣后，將血細胞計數(shù)板靜置數(shù)分鐘；

2)     把血細胞計數(shù)板放置在顯微鏡的載物臺進行觀察-計數(shù)-記錄；

3)     分別計數(shù)大方格1-2-3-4中的細胞總數(shù)。

注意：

1)     計數(shù)時建議重復(fù)1-2次，取平均值，減小計數(shù)誤差；

2)     四個區(qū)域的細胞數(shù)量偏差不應(yīng)超過 5%，否則要重新加樣。

3)     對橫跨刻度上的細胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右"的原則進行計數(shù)。

4)    為降低細胞計數(shù)誤差，濃度最好控制在1×10⁶個細胞/mL左右；

5)     計數(shù)時，只計數(shù)完整的細胞，如有聚團細胞則按一個細胞進行計數(shù)。

5、 血細胞計數(shù)板濃度計數(shù)標準

（中國的標準：JJG 552-1988血細胞計數(shù)板試行檢定規(guī)程）

1)     如上圖所示，當血細胞計數(shù)板放上蓋玻片后，平臺與蓋玻片之間的距離 (即高度)為 0.1mm；

2)     平臺中心部分各以3mm長，3mm寬精確劃分為9個大方格，稱為計數(shù)室，每個大方格面積為1mm²，體積為 0.1mm³；

3)     細胞濃度 (mL)=(四個大方格細胞數(shù)之和)/4X2（染液稀釋倍數(shù)）X 10⁴⁼？個細胞/mL。

注意：如果不加入臺盼藍染料，則無需乘以2。

相信有些小伙伴，即使花費很長時間熟悉，并實際接觸細胞計數(shù)操作的全部流程后，還是會有結(jié)果不滿意、人工操作效率低、結(jié)果無法一目了然、細胞計數(shù)數(shù)到“眼疼"的情況。

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7、血細胞計數(shù)板上機實拍圖案例

8、細胞計數(shù)結(jié)果包括

總細胞濃度、活/死細胞濃度、活/死細胞比率、總細胞聚團率/濃度、活細胞聚團率/濃度、死細胞聚團率/濃度等計數(shù)結(jié)果、原始圖片、識別圖片、柱狀圖、散點圖、等高線圖、報告單等…

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